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期刊：bioRxiv-PlantBiology

发表时间：年8月24日

作者：JuanM.Debernardi

一个包含生长调节因子(GRF)及其辅助因子GRF-相互作用因子(GIF)的嵌合体可提高转基因植物的再生效率

基因组编辑允许精确的DNA操作，但其潜力在许多作物中由于再生效率低和可转化基因型的数量少而受到限制。本研究表明，小麦生长调节因子4(GRF4)及其辅助因子GRF相互作用因子1(GIF1)等嵌合蛋白的表达显著提高了小麦、小黑麦和水稻的再生效率和速度，并增加了可转化小麦基因型的数量。此外，GRF4-GIF1在没有外源细胞因子的情况下诱导小麦的高效再生，有助于选择没有选择性标记的转基因植株。通过结合GRF4-GIF1和CRISPR-Cas9技术，我们能够生成大量编辑过的小麦植株。

GRF4-gif1转基因植株具有可育性，没有明显的发育缺陷，这可能是由于成年组织中对GRF4的转录后调控机制所致。最后，我们发现一个双子叶GRF-GIF嵌合体提高了柑橘的再生效率，这表明该策略可以扩展到双子叶作物。

最近的研究报道，通过过表达植物发育调节因子，包括叶酚1、叶酚2、蘑菇(WUS)和BABYBOOM(BBM)，可以提高植物再生效率。这些基因促进了胚胎样结构的产生、体细胞胚胎或芽的再生。例如，玉米发育调控因子BBM和WUS2的过表达对以前不可转化的玉米自交系和其他单子叶植物产生了较高的转化频率。另一种策略是使用不同的发育调节因子组合，在不进行组织培养的情况下诱导双子叶植物的从头分生组织。尽管如此，仍然需要新的方法来提供有效的转化，增加的易用性，并适用于更广泛的顽固性物种和基因型。

我们最近发现，一个包含GRF转录因子及其GIF辅助因子的嵌合蛋白序列的表达显著提高了单子叶和双子叶植物的再生效率，增加了可转化品种的数量，并导致可育转基因植株。GRF转录因子在被子植物、裸子植物和苔藓中高度保守。它们编码具有保守的QLQ和WRC结构域的蛋白质，分别介导蛋白质-蛋白质和蛋白质-dna的相互作用。许多被子植物和裸子植物的转基因基因携带microRNAmiR的靶位点，这降低了转基因基因在成熟组织中的功能。

GRF蛋白与GIF辅助因子形成复合物，这些复合物也与染色质重塑复合物相互作用。多种水平的调控控制了体内功能性GRF/GIF复合物的组装效率。GIF基因的功能缺失突变模拟了在GRF功能缺失突变体或过表达miR的植物中观察到的器官大小减少，而过表达GIF可促进器官生长，并能提高GRF的活性。此外，拟南芥GRF3和GIF1的表达同时增加促进了叶片大小的更大增加相对于个体基因。基于观察到grf和gif相互作用形成蛋白复合物，我们决定评估小麦单个多肽编码的GRF-GIF嵌合体的影响。

我们在小麦基因组中鉴定出10个grf(补充图1A)，并根据其与OsGRF4的同源性选择小麦GRF4，促进水稻和小麦谷物和植物生长。在三个小麦GIF辅助因子中，我们选择了拟南芥和水稻GIF1最接近的同源物(补充图1B)，因为该分支的成员已被证明可以控制拟南芥、水稻和玉米的生长。然后，我们结合GIF1和GRF4，生成一个GRF1-GIF1包含一个短基因间隔区(图1A)的嵌合体，引物见补充表1（补充方法1）。在玉米泛素启动子(Ubi：：GRF4-GIF1，补充方法1)下过表达GRF4-GIF1嵌合体的转基因植株具有生育能力，并表现出正常的表型(图1B)。然而，它们每穗的籽粒数减少了23.9%，籽粒重增加了13.7%（补充表2）。

我们在四倍体小麦Kronos中进行了18次转化实验（补充方法2），估计了至少有一个再生的愈伤组织数量/再生芽/接种胚胎的总数（补充表3总结了再生频率和接种胚胎的数量）。这些再生效率用实验作为块进行五种不同的比较。在15个实验中（补充表3）中，GRF4-GIF1嵌合体的平均再生效率（65.1±5.0%）比空载体对照(8.3±1.9%，P0.，图1C和D)高7.8倍.

我们假设GRF4-GIF1嵌合体再生效率的提高与之相关GRF-GIF复合物能够调节干细胞向转运扩增细胞之间的过渡，以及它们在广泛的器官中促进细胞增殖的能力。小麦GRF4-GIF1嵌合体也加速了再生过程，这使我们能够开发出一种更快的小麦转化方案需要56d，而不是本文中所有小麦实验所需的91d（补充图2）。

然后，我们比较了GRF4和GIF1在嵌合体中融合或通过单个Ubi启动子在同一结构中单独表达（未融合）对再生效率的影响（补充表3）。在5个不同的实验中，分离的GRF4和GIF1基因的平均再生效率（38.6±12.9%）(P0.)显著低于GRF4-GIF1嵌合体的平均再生效率(62.6±10.3%，图1E)。这一结果表明，在嵌合体中强制接近这两种蛋白增加了其诱导再生的能力。

在另外5个单独的转化实验（补充表3）中，我们观察到与GRF4-GIF1嵌合体相比（20.±11.4%）或GIF1基因（17.2±6.6%）(54.6±9.8%，对比P=0.，图1F)。用单个基因转化的愈伤组织的再生效率约是对照组的3倍（6.0±3.0%），但在Tukey试验中差异不显著(图1F)。

我们生成了GIF1被其他GIFs取代或GRF4被其他grf取代的嵌合体，并分别在三个和四个独立的实验中测试了它们的再生效率（补充表3）。GRF4-GIF1组合的再生效率高于GRF4-GIF2和GRF4-GIF3组合(对比组P=0.)，三种嵌合体的再生效率均高于对照组(TukeytestP0.05，图1G)。同样，与GIF1密切相关的GRF4和GRF5基因的嵌合体诱导的再生效率高于与GRF1融合的GRF9基因的嵌合体的再生效率(P=0.，图1H)。只有包括GRF4和GRF5基因在内的嵌合体与对照组有显著差异(TukeyP0.05，图1H)。

然后，我们测试了GRF4-GIF1嵌合体从商业硬质、面包小麦和小麦中产生转基因植物的潜力，这些转基因植物在之前的加州大学植物转化设施的实验中抵抗农杆菌介导或再生效率较低。利用GRF4-GIF1嵌合体，我们观察到四倍体小麦沙漠王(63.0±17.0%vs.2.5±2.5%，2次实验)和六倍体小麦外野德(61.8±8.2%vs.12.7±10.3%，三个实验)相对于对照再生频率显著增加。六倍体小麦品种哈恩和华彩乐段和小麦育种系UC，我们无法生成转基因植物使用日本烟草协议，我们观察到再生频率9到19%的GRF4-GIF1嵌合体(与0%的控制，补充图3和补充表4和B)。

在品种中采用日本烟草法之前，已有较高的小麦再生效率。然而，该公司警告说，这些高值需要对多个因素进行优化和较窄的最优窗口，并且“当其中一个因素变得次优时，这些值可能会大幅下降”（补充表5）。GRF4-GIF1嵌合体的加入克服了这些狭窄的最佳窗口的一些限制，使我们能够使用更短的协议和在不同的环境条件下获得的胚胎（1.5-3.0毫米）获得较高的转化效率。即使我们使用不同的载体和基因型，并且没有胚胎切除，也可以观察到较高的再生效率，这是日本烟草技术的关键步骤。

为了测试我们的方法的稳健性，我们将我们的GRF4-GIF1载体转移到JohnInnes中心转化设施，用他们最近发表的小麦转化方法进行测试。用GRF4-GIF1嵌合体转化的田间植株的再生效率为77.5%，而对照植株的再生效率为33.3%(补充表4A)。综上所述，这些结果表明，GRF4-GIF1嵌合体的加入提高了不同条件和方案下小麦转化的稳健性。

我们还在水稻品种Kitaake中检测了小麦GRF4-GIF1嵌合体（补充方法3）。在4个独立的转化实验中，我们观察到小麦GRF4-GIF1嵌合体转化的愈伤组织的水稻再生效率提高了2.1倍（平均42.8±2.6%），比对照载体（20.3±20.3±2.9%，补充表6）。这些结果表明，小麦GRF4-GIF1嵌合体能有效地提高另一种重要的农艺性单子叶植物的再生能力。

在许多植物转化系统中，再生芽需要细胞分裂素(图2A)。有趣的是，在这两个实验室中，我们都观察到接种了GRF4-GIF1嵌合体转化的农杆菌的Kronos和Fielder胚胎能够在没有细胞分裂素的生长素培养基中快速再生绿芽(图2B)。

然后，我们检测了稳定的GRF4-GIF1转基因（=27）和非转基因（=26）T1姐妹系的未成熟胚胎的再生效率。在此条件下，GRF4-GIF1转基因植株的再生效率（77.8%）显著高于非转基因姐妹株系（11.5%，补充图4）。这些结果表明，GRF4-GIF1嵌合体可以在不添加外源细胞分裂素的情况下，促进小麦的胚胎发生、芽增殖或两者兼有。

基于之前的结果，我们开发了一种方案，在生长素培养基中选择转基因芽，而不使用抗生素标记。在三个实验中，我们使用GRF4-GIF1无标记载体恢复了40个芽，使用空载体恢复了15个芽。基因分型结果显示，40个GRF4-GIF1芽中有10个（25%）是转基因的，而对照中没有一个是阳性的(图2C)。这些在没有选择标记的情况下过表达GRF4-GIF1嵌合体的高再生转基因植物可能被用于未来的转化实验，利用可选择的标记整合其他基因。该方法可以为GRF4-GIF1和第二转基因生成单独的插入位点，促进GRF4-GIF1插入在下一代的分离。

这种策略对于基因组编辑是不必要的，因为CRISPR-Cas9和GRF4-GIF1序列都可以在编辑基因组的期望区域后被分离在一起。因此，GRF-GIF系统是将基因组编辑技术应用到再生效率低的作物的理想选择。作为概念证明，我们生成了一个用于农杆菌转化的二元载体，该载体包含在同一T-DNA区域的GRF4-GIF1嵌合体、Cas9和靶向小麦基因Q(=AP2L5)的gRNA(图3A和B)。我们从32个被感染的愈伤组织中恢复了30个独立的转基因事件(效率为93.7%，图3C)。

对所有30个转基因基因的破坏显示了cas9诱导的编辑（补充图5）。我们对10个独立品系的PCR产物进行了测序，并进行了确认编辑(图3D)。在10株转移到土壤中的T0植株中，有7株表现出明显的q缺失突变表型(图3E)，其余3株在抽穗前死亡。这些T0转基因植株具有正常的育性，编辑的Q基因和CRISPR-Cas9/GRF4-GIF1结构有望在T1后代中分离，促进无转基因的编辑植株的选择。

最后，我们进行了一系列的柑橘转化实验，以测试GRF-GIF技术在一种再生效率有限和基于器官生成的转化方案的双子叶作物中的效果。我们利用与小麦GRF4和GIF1最接近的同源物，获得了一个柑橘和一个异源葡萄GRF-GIF嵌合体(补充图1A和B)。在香橼根茎的三个独立转化实验中（补充方法4），用柑橘和葡萄GRF-GIF嵌合体转化上胚轴。柑橘GRF-GIF嵌合体转化的异型与空载体对照转化的异型相比，再生频率增加了4.7倍(补充图6A)。异源葡萄GRF-GIF嵌合体对柑橘再生效率的提高与柑橘嵌合体相似(补充图6B)。

我们还测试了一个抗miR的葡萄GRF-GIF版本(此后，rGRF-GIF)的效果，其中我们在miR的GRF结合位点引入沉默突变，以避免分裂(补充图6B和C)。在三个独立的实验中，我们观察到葡萄rGRF-GIF嵌合体产生的转基因柑橘事件的频率最高(比对照增加了7.4倍，P为0.05)。比较对照组与三种联合GRF-GIF结构体的统计分析也很显著(P=0.，补充图6D和补充表7)。尽管rGRF-GIF结构的再生频率更高，但它还需要额外的优化（例如，一个诱导系统），因为一些转基因事件产生了较大的愈伤组织，但不能产生芽(补充图6B)。

综上所述，GRF4-GIF1嵌合体的表达显著提高了小麦再生的效率和速度，以及产生大量可编辑植物的能力，扩大了可转化基因型的范围，消除了细胞因子的再生需求，从而消除了基于抗生素的选择性标记的需要。GRF4-GIF1技术可以获得可育和正常的转基因植物，而不需要专门的启动子或转基因切除，克服了与其他形态发生基因的转化技术的一些局限性（补充表8）。

由于GRF4-GIF1可能比Bbm-Wus2在分生组织分化和干细胞增殖的后期发挥作用，因此有可能结合这两种技术，并在抗性基因型的再生效率方面具有协同作用。一项同时独立的研究表明，拟南芥AtGRF5和AtGRF5同源物的过表达正向促进了本文未检测的单子叶和双子叶植物的再生和转化。

我们假设，通过将GRF4-GIF1嵌合体纳入现有的方案，GRF4-GIF1技术的好处可以快速扩大到再生效率较低的作物上。这一假设得到了整个植物界的GRF和GIF蛋白的高度保守，以及本研究中观察到的水稻和柑橘再生频率增强的支持。

图1。GRF4（蓝色）-GIF1（粉红色）嵌合体的示意图。黑色的区域代表一个四个氨基酸的间隔区。B)GRF4-GIF1转基因小麦植株正常且可育。C)具有代表性的转化显示，在GRF4-GIF1嵌合体的存在下，Kronos转化过程中再生芽的频率高于对照组。D-H)利用实验和s.e.m.实验转基因Kronos植株的平均再生频率作为误差条。所有实验均以空pLC41载体作为对照和小麦GRF4-GIF1嵌合体。基因型以下数字为接种胚胎总数，条形图以上不同字母表示显著差异(P0.05，Tukey检验)。D)

控制vs。GRF4-GIF1，n=14(****P0.，平方根变换)。E)对照、GRF4-GIF1和载体包括GRF4和GIF1，由单独的玉米泛素启动子(GRF4+GIF1)驱动，n=5(对比GRF4-GIF1vs。GRF4+GIF1，**P=0.)。F)对照、GRF4-GIF1和载体仅包括GIF1或GRF4、n=5(对比GRF4-GIF1与联合GRF4和GIF1P=0.)。G)对照和GRF4嵌合体融合到GIF1、GIF2或GIF3，n=3(GIF1嵌合体与GIF2和GIF3**P=0.的对比)。H)结合小麦与GIF1融合的不同GRF基因的对照和嵌合体(n=4，除GRF5n=3外)**P=0.对比GRF4-GIF1和GRF5-GIF1联合嵌合体（进化相关）与GRF1-GIF1和GRF9-GIF1联合嵌合体（更远亲）。在所有检验中，残差的正态性由Shipiro-Wilk检验确认，方差的齐性由Levene检验确定（原始数据见补充表3）。

图2。GRF4-GIF1嵌合体在没有细胞分裂素的情况下诱导胚胎发生。A)小麦转化的不同步骤示意图。B).无潮霉素的生长素培养基中的代表性愈伤组织。值得注意的是，在没有细胞分裂素的情况下，用小麦GRF4-GIF1嵌合体转化的愈伤组织中生长的绿芽（红色箭头）。控制组：pLC41。C)转基因特异性PCR产物（箭头）显示，4株转基因植株的植株和GRF4-GIF1嵌合体再生的植株中有5株转基因植株没有转基因植株。

图3。利用GRF4-GIF1-CRISPR-Cas9技术高频率基因组编辑植物。A)技术结合在一个单一的矢量中。用引导RNA(gRNA)靶向的基因Q(AP2L-A5)，结合两种技术的载体示意图(LB=左边界，Hyg。=潮霉素耐药性，RB=右边界)。C)用空载体和GRF4-GIF1-CRISPR-Cas9-gRNA-AP2L-A5结构转化胚胎的Kronos茎再生（再生效率93.7%）。D)所有10个已测序的转基因T0植株均显示了AP2L-A5的编辑功能。10种植物中有7株(T#1到T#10)携带两种不同的突变(a1和a2)，证明了较高的编辑效率。E)编辑的T0植株显示每个小穗的小花数量增加(q缺失植株的特征)